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篇(1)

【關(guān)鍵詞】人乳鐵蛋白；癌細(xì)胞；細(xì)胞增殖

人乳鐵蛋白(HumanLactoferrin，hLF)是主要存在于人乳清中的球蛋白，乳汁別是初乳中含量最高，具有廣譜抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用。國外有學(xué)者將其應(yīng)用于腫瘤患者的治療，但是對其作用機(jī)制的研究較少。目前國內(nèi)較少有關(guān)于hLF作用于細(xì)胞的報道，我們選用易早期轉(zhuǎn)移的鼻咽癌(NPC)細(xì)胞作為研究對象，以中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、人肝臟細(xì)胞(L02)作為正常細(xì)胞對照，觀察hLF在體外是否具有抑制癌細(xì)胞生長的作用，探討hLF抗腫瘤的作用機(jī)制，從而為腫瘤的治療提供研究基礎(chǔ)，為臨床實(shí)驗(yàn)及應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。

一、材料與方法

1.1材料人鼻咽癌細(xì)胞(CNE)、中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、人肝臟細(xì)胞(L02)均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞資源中心。重組hLF(Lot:L0520，溶于PBS中，儲存濃度5mg/ml，-20℃儲存?zhèn)溆?和噻唑藍(lán)(MTT，Lot:M2128)均購自Sigma公司。RPMI1640、胎牛血清購自HyClone公司。其他試劑均為分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)各細(xì)胞系均應(yīng)用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，5%CO2，37℃培養(yǎng)。

1.2.2MTT法檢測細(xì)胞增殖設(shè)空白對照組和hLF干預(yù)組。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種數(shù)為5×104/孔。每組細(xì)胞設(shè)5個平行孔，各組細(xì)胞分別加入不同濃度的hLF(0，1.25×10-3,2.5×10-3，5×10-3，10×10-3，20×10-3，40×10-3g/L)，每孔均為200μl。作用24h后，加入MTT(5g/L，每孔20μl)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，測定A570nm吸光度。

1.2.3細(xì)胞形態(tài)觀察細(xì)胞經(jīng)hLF處理后，傾去上層懸浮死細(xì)胞并用PBS洗兩遍，加入新鮮培養(yǎng)基。同樣處理對照孔細(xì)胞，將細(xì)胞置于倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)用x±s表示，組間比較用方差分析。

二、結(jié)果

2.1重組hLF對鼻咽癌細(xì)胞CNE、人肝臟細(xì)胞L02、中國倉鼠細(xì)胞CHO系的增殖能力的影響對CNE呈現(xiàn)劑量依賴性的抑制作用，而對正常細(xì)胞無抑制作用。人乳鐵蛋白對各細(xì)胞體外增殖的影響與空白對照比較:1)P<0.05

2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯微鏡鏡下可見，空白對照組癌細(xì)胞密集成片生長，如鋪路卵石狀，細(xì)胞膜圓潤，透明，顆粒較少，細(xì)胞間界限清楚，并可隱約見到細(xì)胞核。hLF處理組癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變，隨hLF濃度增加，細(xì)胞從正常的增殖旺盛的貼壁生長，逐漸表現(xiàn)為生長緩慢，黏附力降低，細(xì)胞變圓，細(xì)胞胞質(zhì)粗糙，細(xì)胞內(nèi)顆粒逐漸增多，且透明度降低，立體感較差，細(xì)胞形態(tài)完整性受損，而正常細(xì)胞在細(xì)胞鏡檢圖hLF作用下無顯著變化。

三、討論

hLF多種生物學(xué)功能通過免疫系統(tǒng)的激活與調(diào)節(jié)得以實(shí)現(xiàn)。Bezaul研究發(fā)現(xiàn)，乳鐵蛋白能抑制鼠實(shí)體瘤的生長和轉(zhuǎn)移。腫瘤內(nèi)注射LF，可以明顯的減小實(shí)體瘤的體積，且作用效果與LF干預(yù)天數(shù)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，乳鐵蛋白的抗頭頸部腫瘤作用是通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)現(xiàn)的。Wolf等發(fā)現(xiàn)，人乳鐵蛋白通過阻斷頭頸部腫瘤細(xì)胞由G0到G1期的轉(zhuǎn)化來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。人乳鐵蛋白對鼠的SCC細(xì)胞系生長的抑制作用，與劑量成正相關(guān)；而且人乳鐵蛋白抑制頭頸部細(xì)胞癌的作用是通過直接的細(xì)胞毒作用及系統(tǒng)性的免疫調(diào)節(jié)作用實(shí)現(xiàn)的。

Varadhachary等人做了大量的口服臨床試驗(yàn)，證實(shí)乳鐵蛋白無藥物相關(guān)的有害作用。鼻咽癌作為頭頸部腫瘤之一，其惡性程度較高，早期即可出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，臨床上有轉(zhuǎn)移至骨盆、肺、肝等多器官的病例。選用鼻咽癌細(xì)胞作為研究對象，具有一定的代表意義。

本研究結(jié)果顯示，人乳鐵蛋白可以抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，且呈劑量依賴性，對正常細(xì)胞的增殖無明顯抑制作用。這一結(jié)果，為開發(fā)乳鐵蛋白的抗癌功效提供了理論依據(jù)。

【參考文獻(xiàn)】

篇(2)

MAPK信號通路在多種惡性腫瘤（包括卵巢癌）細(xì)胞的增殖、凋亡和化療藥物作用及化療藥物耐受發(fā)生中起重要作用[4-6]。MAPK家族包括p38 MAPK、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-jun氨基末端激酶（JNK）等多個亞家族。這些亞族組成多條信號通路，其中最主要的有P38途徑、ERK1/2途徑和JNK途徑。MAPK家族成員被磷酸化激活后，將細(xì)胞外的各種刺激信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞內(nèi)級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡及對藥物的敏感性[7]。有研究發(fā)現(xiàn)激活的AKT和MAPK，依次磷酸化BAD和BCL-2，進(jìn)而削弱鉑類和紫杉烷的促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用[8]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路在晚期上皮性卵巢癌組織中異常激活，并發(fā)現(xiàn)磷酸化p38 MAPK在耐藥卵巢癌組織中表達(dá)較非耐藥卵巢癌組織中升高。

二甲雙胍是一種用于治療2型糖尿病的雙胍類降糖藥，最近兩項(xiàng)大型流行病學(xué)調(diào)查研究表明：長期服用二甲雙胍能夠降低卵巢癌的發(fā)病率，而且二甲雙胍能夠顯著延長卵巢癌合并糖尿病患者的無進(jìn)展生存期[9]。二甲雙胍通過STK11（也稱LKB1）激活A(yù)MPK，激活過程涉及多個參與細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)的信號通路，其中包括MAPK信號通路[10]。但二甲雙胍是否能夠增加化療藥物對卵巢癌細(xì)胞的敏感性及相關(guān)的作用機(jī)制研究尚屬空白。

本研究首先觀察二甲雙胍對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響，以及二甲雙胍是否可增強(qiáng)順鉑的化療敏感性，并通過檢測二甲雙胍對化療藥物相關(guān)的重要信號通路MAPK信號通路的調(diào)節(jié)作用來探討相關(guān)的作用機(jī)制。以期尋找能提高卵巢癌化療敏感性的新的治療方案。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和試劑 人卵巢漿液性狀囊腺癌細(xì)胞系SKOV3，中、高分化，貼壁生長，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞系常規(guī)3～5 d傳代。兔抗人p38 MAPK多克隆抗體、兔抗人P-p38 MAPK單克隆抗體；兔抗人AMPK多克隆抗體、兔抗人P-AMPK單克隆抗體，兔抗人GAPDH單克隆抗體購自Cell signaling公司；二甲雙胍、順鉑購自美國Sigma公司，胎牛血清購自杭州四季青公司；Western blotting檢測試劑盒購自武漢博士德公司；Trizol 試劑購自美國Invitrogen公司；BrdU標(biāo)記及檢測試劑盒購自德國Roche公司。

1.2 方法

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，組間差異采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的情況 二甲雙胍能夠抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，并且這種抑制作用能夠被Compound C所削弱。隨著二甲雙胍濃度（1×10-3 mol/L，1×10-4 mol/L，1×10-5 mol/L）的增加，其對卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)（*P<0.05，**P<0.01）。其中1×10-4 mol/L

和1×10-5 mol/L的二甲雙胍能夠顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長。而AMPK阻斷劑Compound C（5×10-7 mol/L，1×10-6 mol/L）均可削弱二甲雙胍的這種抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的作用。1×10-6 mol/L Compound C與二甲雙胍聯(lián)合應(yīng)用，其對卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制作用與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖1。

2.2 二甲雙胍能夠增強(qiáng)卵巢癌對順鉑的敏感性 將不同濃度的順鉑（1、2、4、6 ng/L）加入卵巢癌細(xì)胞SKOV3中，加入或者不加入0.1 mM二甲雙胍孵育細(xì)胞48 h后，結(jié)果表明：0.1 mM的二甲雙胍聯(lián)合順鉑（1、2、4、6 ng/mL）作用于卵巢癌細(xì)胞時，順鉑抑制卵巢癌細(xì)胞生長的作用顯著增強(qiáng)（P<0.05）。其中6 ng/mL順鉑聯(lián)合0.1 mM的二甲雙胍對卵巢癌細(xì)胞的抑制作用最顯著（P<0.05），見圖2。

2.3 二甲雙胍聯(lián)合p38 MAPK阻斷劑SB203580能夠增強(qiáng)二甲雙胍的抗卵巢癌細(xì)胞增殖的作用 單獨(dú)應(yīng)用SB203580（5[dylw.net提供專業(yè)寫作論文和服務(wù).]、10 ?M）能抑制卵巢癌SKOV3的增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。二甲雙胍（0.1 mM）和SB203580（5、10 ?M）聯(lián)合應(yīng)用對卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖的抑制作用顯著增強(qiáng)（*P<0.05，**P<0.01）。其中0.1 mM二甲雙胍與10 ?M p38 MAPK阻斷劑SB203580聯(lián)合應(yīng)用對卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖的抑制作用最顯著（**P<0.01），見圖3。

2.4 二甲雙胍激活A(yù)MPK信號通路，并抑制MAPK信號通路 二甲雙胍（10、20 mM）作用卵巢癌細(xì)胞SKOV3 6 h后，磷酸化AMPK水平顯著增高，且升高的磷酸化AMPK水平能夠被AMPK阻斷劑Compound C所削弱。經(jīng)二甲雙胍（1、10 mM）處理后，卵巢癌細(xì)胞SKOV3中磷酸化p38 MAPK蛋白水平顯著降低，見圖4。

3 討論

最近兩項(xiàng)大型流行病學(xué)資料顯示：（1）長期服用二甲雙胍可降低卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險；（2）在合并糖尿病的卵巢癌患者中，服用二甲雙胍的患者較未服用患者的無病進(jìn)展存活率顯著增加[10-11]。筆者研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能夠抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，這種作用是通過激活A(yù)MPK信號通路實(shí)現(xiàn)的。AMP激活蛋白激酶（AMPK）是主要的細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器，是代謝和腫瘤互相作用的主要調(diào)節(jié)子[11]。二甲雙胍以一種非胰島素介導(dǎo)的方式直接調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡，二甲雙胍通過激活A(yù)MPK，激活的AMPK調(diào)節(jié)多個信號通路，其中包括mTOR和MAPK信號通路，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡。

化療藥物引起的細(xì)胞損傷主要是通過、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路實(shí)現(xiàn)的，并且化療藥物耐受的形成也與MAPK信號通路激活密切相關(guān)[6]。MAPK家族包括P38MAPK、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-jun氨基末端激酶（JNK）等多個亞家族。這些亞族組成多條信號通路，其中最主要的有P38途徑、ERK1/2途徑。MAPK信號通路在多種惡性腫瘤（包括卵巢癌）細(xì)胞的增殖、凋亡和化療耐藥產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用[6]。MAPK家族成員被磷酸化激活后，將細(xì)胞外的各種刺激信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞內(nèi)級聯(lián)反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)激活的MAPK，依次磷酸化BAD和BCL-2，進(jìn)而削弱鉑類和紫杉烷的促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用，使腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生抵抗[12]。筆者的研 究結(jié)果表明：二甲雙胍可能通過激活A(yù)MPK信號通路，進(jìn)而抑制MAPK信號通路來抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的。這與以上研究結(jié)果相一致。

筆者的研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)：二甲雙胍（0.1 mM）能夠增強(qiáng)順鉑抑制卵巢癌細(xì)胞增殖作用。與最近的幾項(xiàng)研究結(jié)果一致：二甲雙胍能改善乳腺癌化療耐藥，并且發(fā)現(xiàn)二甲雙胍的這種對化療耐藥的調(diào)節(jié)作用是通過激活A(yù)MPK實(shí)現(xiàn)的[13]。Tseng等[16]在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)二甲雙胍不僅能夠降低紫杉醇誘導(dǎo)p38 MAPK介導(dǎo)的切除修補(bǔ)基因（ERCC1）的表達(dá)，還能夠增加紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)。另外在肺癌、乳腺癌和前列腺癌裸鼠體內(nèi)模型中，二甲雙胍能夠顯著增強(qiáng)順鉑、紫杉醇和多柔比星對腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用，并且二甲雙胍能夠減少多柔比星的用量，延長疾病緩解期[14-15]。但這些結(jié)果說明二甲雙胍可能通過激活A(yù)MPK調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。

筆者同時發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍聯(lián)合MAPK信號通路抑制劑能夠增強(qiáng)二甲雙胍的抗腫瘤作用。p38 MAPK、p42 MAPK信號通路抑制劑可增加二甲雙胍和紫杉醇的抗腫瘤作用[16]。Liu等[17]在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)二甲雙胍和mTOR抑制劑（RAD001）聯(lián)合可增強(qiáng)化療藥物的細(xì)胞毒作用，聯(lián)合應(yīng)用二甲雙胍、化療藥物和mTOR阻斷劑能夠[dylw.net提供專業(yè)寫作論文和服務(wù).]協(xié)同抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。Monteagudo等[18]在前列腺癌細(xì)胞中，p42 MAPK siRNA能夠顯著增強(qiáng)二甲雙胍的抗腫瘤作用。因此，鉑、紫杉醇化療的基礎(chǔ)上聯(lián)合二甲雙胍和信號通路阻斷劑可能會增強(qiáng)卵巢癌化療的療效，這些研究結(jié)果都與筆者的研究結(jié)果一致。

總之，二甲雙胍能夠提高卵巢癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞對順鉑的敏感性，并且這種作用是依賴于AMPK激活的；p38 MAPK阻斷劑SB203580也能夠抑制SKOV3的增殖，二甲雙胍能夠增強(qiáng)這種抑制作用。二甲雙胍的這種增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對順鉑敏感性的作用可能是通過激活A(yù)MPK，從而抑制MAPK信號通路實(shí)現(xiàn)的。筆者的研究結(jié)果為臨床應(yīng)用二甲雙胍及MAPK信號通道阻斷劑來提高卵巢癌化療藥物的敏感性提供理論支持，為卵巢癌的臨床聯(lián)合用藥提供新思路。

參考文獻(xiàn)

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篇(3)

論文摘要 目的：探討糖尿病足中醫(yī)辨證分型與血管細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原的表達(dá)差異。方法：對32例截肢的糖尿病足患者按中醫(yī)辨證分為氣血兩虛瘀阻證、脈絡(luò)瘀熱證、脈絡(luò)熱毒證和氣陰兩虛瘀阻證，分別對其截肢肢體的脛后動脈應(yīng)用免疫組化法對細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原（Ki67）的表達(dá)進(jìn)行觀察、分析。結(jié)果：Ki67的陽性表達(dá)與糖尿病足動脈硬化閉塞程度呈負(fù)相關(guān)，與血管炎癥病變程度呈正相關(guān)。結(jié)論：炎癥在糖尿癥的大血管病變的過程中起到了重要的作用。

糠尿病足是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，據(jù)統(tǒng)計1996年全球糖尿病患者1．2億，預(yù)計到2025年，將達(dá)到2．5億以上，而大約15％的糖尿病患者將在其生活的某一時間發(fā)生足潰瘍或壞疽[1]。目前對于糖尿病足病因及發(fā)病機(jī)制雖然還不是完全清楚，但大家公認(rèn)糖尿病合并大血管病變導(dǎo)致動脈粥樣硬化是糖尿病足發(fā)病的最主要因素?，F(xiàn)將2004年10月～2005年5月間我們收治的32例糖尿病足患者的截肢動脈標(biāo)本的血管細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原(Ki67)與其中醫(yī)辨證分型的相關(guān)性研究情況報告如下。

1 臨床資料

1．1 一般資料：32例均為天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院和天津中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2004年10月～2005年5月間的住院患者，其中男性24例，女性8例；年齡50～86歲，平均年齡69．2歲；糖尿病病程最長30年，最短6年，平均18±2．4年。

1．2 診斷標(biāo)準(zhǔn)：糖尿病足的診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2000年中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)會第二屆糖尿病足會議所制訂的“糖尿病足(肢端壞疽)檢查方法及診斷標(biāo)準(zhǔn)”。

1．3 截肢標(biāo)準(zhǔn)：參照國際糖尿病足工作組編寫的《糖尿病足國際共識》中關(guān)于“大截肢的定義、標(biāo)準(zhǔn)和指標(biāo)”[2]執(zhí)行。

1．4 中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)：參照《中醫(yī)外科學(xué)(第七版)》及《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則·脫疽》之中醫(yī)辨證分型方案分為氣陰兩虛瘀阻證、脈絡(luò)瘀熱證、氣血兩虛瘀阻證、脈絡(luò)熱毒證四型。

2 觀察方法

2．1 標(biāo)本取材：壞疽截肢標(biāo)本32例，其中按中醫(yī)辨證分型氣血兩虛瘀阻組10例，脈絡(luò)瘀熱組10例，氣陰兩虛瘀阻組4例，脈絡(luò)熱毒組8例，取各例標(biāo)本下肢脛后動脈。標(biāo)本經(jīng)過10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，備用。

2．2 設(shè)備、試劑：美國PENGUIN-600CL自動圖像分析系統(tǒng)，細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原(Ki67)抗體PV9000試劑盒DAB購于北京中山生物技術(shù)有限公司。

2．3 免疫組織化學(xué)法：標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，采用PV法進(jìn)行免疫組化染色，染色過程嚴(yán)格按試劑盒染色程序進(jìn)行，選取已知的陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。觀察細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原(Ki67)，陽性物質(zhì)呈棕黃色細(xì)顆粒狀于細(xì)胞核表達(dá)，采用美國PENGUIN-600CL圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，選取病變處每500個細(xì)胞Ki67的陽性表達(dá)率作為其陽性表達(dá)指數(shù)。統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS10．0軟件包進(jìn)行方差分析。

3 結(jié)果

3．1 中醫(yī)各證型所占比例以及年齡、性別分布：各證型比例，氣血兩虛瘀阻組10例（31．25%），脈絡(luò)瘀熱組10

例（31．25%），氣陰兩虛瘀阻組4例（12．5%），脈絡(luò)熱毒組8例（25．0%）。年齡、性別分布情況，見表1。

表1 32例患者年齡、性別分布 n（%）

性別n50~60歲61~70歲71~80歲80歲以上男24（ 75．0）4（12．5） 8（25．0）11（34．4）1（3．1）女 8（ 25．0）1（ 3．1） 3（ 9．3） 4（12．5）0 總計32（100．0）5（15．6）11（34．4）15（46．9）1（3．1）3．2 免疫組織化學(xué)法觀察各證型Ki67表達(dá)差異：具體情況見表2。

表2 各證型Ki67陽性表達(dá)指數(shù)比較 （%）

證型Ki67陽性表達(dá)指數(shù)脈絡(luò)熱毒 4．87±1．01*氣陰兩虛瘀阻1．86±0．47脈絡(luò)瘀熱1．49±0．13氣血兩虛瘀阻0．30±0．18注：與氣血兩虛瘀阻型比較，*P

氣血兩虛瘀阻證、脈絡(luò)熱毒證、脈絡(luò)瘀熱證、氣陰兩虛瘀阻證中均可見部分細(xì)胞Ki67呈陽性表達(dá)，在脈絡(luò)熱毒證中表達(dá)指數(shù)最高，氣血兩虛瘀阻證中表達(dá)指數(shù)最低，二者比較具有顯著性差異(P

4 討論

Ki67抗原為細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)胞分裂增殖相關(guān)的蛋白抗原，分子量為345kd和395kd，其編碼基因位于第10號染色體上。Ki67的表達(dá)出現(xiàn)于G1中期到晚期，S期和G2期逐漸增加，有絲分裂期達(dá)高峰，分裂后迅速降解或丟失抗原決定簇，到G0期則不表達(dá)，半衰期為lh或更短[3]。有人認(rèn)為它可能是具有蛋白結(jié)合特性的重要結(jié)構(gòu)，在有絲分裂中起著維持DNA規(guī)則結(jié)構(gòu)的重要作用[4]，是一個反映細(xì)胞增殖的敏感指標(biāo)。

在糖尿病足的不同辨證分型中氣血兩虛瘀阻證、脈絡(luò)熱毒證、脈絡(luò)瘀熱證、氣陰兩虛瘀阻證中Ki67表達(dá)均呈陽性，在脈絡(luò)熱毒證中表達(dá)最強(qiáng)、氣血兩虛瘀阻證中表達(dá)最弱，二者相比具有顯著性差異(P＜0．05)。根據(jù)Ki67陽性指數(shù)可以判斷細(xì)胞增殖的活性，指明細(xì)胞增殖與糖尿病足動脈病變的關(guān)系。在糖尿病足的不同辨證分型中動脈的硬化閉塞程度由輕到重依次是脈絡(luò)熱毒證、氣陰兩虛瘀阻證、脈絡(luò)瘀熱證、氣血兩虛瘀阻證。Ki67的陽性表達(dá)與糖尿病足動脈硬化閉塞程度呈負(fù)相關(guān)。而在通過對32例糖尿病足截肢的動脈進(jìn)行病理學(xué)觀察的過程中發(fā)現(xiàn)糖尿病足血管病變主要體現(xiàn)在中動脈的病理學(xué)變化，其中脈絡(luò)熱毒、氣陰兩虛瘀阻兩證型以動脈周圍及全層的炎癥性改變?yōu)橹?；脈絡(luò)瘀熱、氣血兩虛瘀阻證以中膜鈣化、平滑肌細(xì)胞萎縮、變性、壞死及膠原纖維增多及內(nèi)膜粥樣斑塊形成為主，炎癥表現(xiàn)不明顯；而Ki67的陽性指數(shù)與血管炎癥病變程度呈正相關(guān)。這說明炎癥在糖尿病的大血管病變的過程中起了重要的作用，特別是在脈絡(luò)熱毒證、氣陰兩虛瘀阻證兩型，這對臨床具有重要的指導(dǎo)意義。

5 參考文獻(xiàn)

1 Boulton A J. The diabetic foot：a global view. Diabetel Metab Res Rev，2000，16(1)：2．

2 許樟榮，敬華．糖尿病足國際共識．中華糖尿病學(xué)會第二屆足病第一次足病研討會．2002，435．

篇(4)

關(guān)鍵詞：醇提物、細(xì)胞毒、MKN-28、SMMC-7721

中圖分類號：R9694文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-2349（2013）02-0048-02

惡性腫瘤嚴(yán)重的威脅著人類生命和健康，其發(fā)病率和死亡率在世界許多國家和地區(qū)居首位。據(jù)WHO預(yù)測，到2020年全球腫瘤發(fā)病率將上升50%，癌癥病人將增加的近1500萬，惡性腫瘤將成為21世紀(jì)危害人類健康的頭號殺手。目前已上市的抗腫瘤藥物缺乏細(xì)胞毒性特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，往往無選擇地殺傷正常細(xì)胞，特別是增生活躍的造血干細(xì)胞，正常細(xì)胞的損傷常導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，影響治療效果和患者依從性。而近年來，從天然藥物中尋找高效低毒的抗腫瘤藥物成為研究熱點(diǎn)[1]。

景洪哥納香系蕃荔枝科哥納香屬植物，全世界約50種，分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)[2]。我國產(chǎn)10種，分布于西南、華南、臺灣等省區(qū)。在民間主要用于清熱、殺蟲、抗癌、抗瘧等[3]。筆者通過體外觀察景洪哥納香醇提物對兩株人腫瘤細(xì)胞株的抗增殖作用，初步判斷其抗腫瘤活性。為將景洪哥納香抗腫瘤活性的進(jìn)一步研究提供必要的前期基礎(chǔ)。

1材料與方法

11材料人胃癌細(xì)胞MKN-28、人肝癌細(xì)胞SMMC-7721購自于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；RMPI-1640培養(yǎng)基購自于GIBCO公司；新生牛血清購自于杭州四季青試劑公司；胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、噻唑藍(lán)（MTT）購自于Sigma公司；三聯(lián)液（10mL SDS，5mL異丁醇，012mL HCL，定容至100mL）由實(shí)驗(yàn)室自己配置。注射用青霉素鈉、注射用硫酸鏈霉素購自于大連美羅大藥廠。

12細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI-1640培養(yǎng)液含10%新生牛血清、100 kU/L青霉素、100 kU/L鏈霉素，在37 ℃、5 %的二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，25 g/L胰酶+02 g/L EDTA消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

13體外抗增殖作用采用改良MTT法，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以4×104/mL、90 μL /孔接種于96孔板中，分別加入陰性對照組生理鹽水（NS）、陽性對照組（終濃度為01、1、10 μg/mL的順鉑）及終濃度分別為1、3、10、30、100 μg/mL的各種景洪哥納香醇提物，每個濃度均設(shè)4個平行孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，每孔加入5 g/ L MTT 10 μL，振蕩混勻，4h后，每孔加入100 μL三聯(lián)液，12 h后，輕輕振蕩15 min，在酶標(biāo)儀上于490 nm/570 nm雙波長下測定OD值，計算細(xì)胞增殖抑制率：

細(xì)胞抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%

并利用Gwbasic軟件計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2結(jié)果

21形態(tài)學(xué)觀察不同濃度的景洪哥納香醇提物用于兩種人腫瘤細(xì)胞48h后，光學(xué)顯微鏡下觀察可見細(xì)胞增殖被顯著抑制（見圖1、圖2）。高濃度景洪哥納香醇提物與正常組比較，細(xì)胞貼壁能力下降，由不規(guī)則形狀逐漸變圓、皺縮、折光性降低，細(xì)胞數(shù)量顯著減少，可見大量細(xì)胞碎片。且發(fā)現(xiàn)景洪哥納香醇提物對兩株人腫瘤細(xì)胞增殖抑制能力有一定的劑量依賴性。

22體外細(xì)胞增殖抑制作用改良MTT法觀察景洪哥納香醇提物對細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，發(fā)現(xiàn)景洪哥納香醇提物在一定的劑量范圍內(nèi)，可以顯著的抑制MKN-28細(xì)胞的增殖能力，且具有顯著的劑量依賴性，其IC50為3102μg/mL。而其對SMMC-7721同樣具有顯著的細(xì)胞毒作用，但是劑量依賴性不明顯，其IC50為1888μg/mL。觀察發(fā)現(xiàn)，100μg/mL景洪哥納香醇提物對這兩株人腫瘤細(xì)胞增殖抑制率可達(dá)95%以上。隨著濃度的降低，其細(xì)胞毒作用也逐漸降低。（見圖3）

3討論

中醫(yī)藥在治療癌癥方面有其獨(dú)到之處。近年來，從中藥中篩選抗癌活性成分以及抗癌先導(dǎo)化合物已成為這一領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。據(jù)不完全統(tǒng)計，來源于植物藥的抗癌制劑，占總抗癌藥的1/3左右[4]。紫杉醇、喜樹堿、長春新堿等已作為許多腫瘤的首選藥。我國的藥用植物種質(zhì)資源豐富，如果能將中藥中抗腫瘤有效成分分離出來，明確其抗腫瘤作用及機(jī)理，對于抗腫瘤藥物的研制開發(fā)以及腫瘤治療具有非常重要的意義。[JP]

番荔枝科屬植物抗腫瘤活性顯著，在上世紀(jì)90年代就被多位國內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注[5]。景洪哥納香是番荔枝科哥納香屬植物，其抗腫瘤活性近年也開始引起學(xué)者的關(guān)注[6]。筆者對景洪哥納香的醇提物在體外進(jìn)行了初步細(xì)胞毒活性測試，光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)景洪哥納香醇提物高濃度時可以顯著抑制細(xì)胞增殖，且發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞碎片，提示筆者其抗MKN-28增殖作用的機(jī)制可能是直接殺死細(xì)胞，而不僅僅是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。改良MTT法研究發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤活性顯著，且具有一定的劑量依賴性。提示筆者可以進(jìn)一步觀察其對其它人腫瘤細(xì)胞株細(xì)胞毒作用如何、以及其細(xì)胞毒活性是否存在時間依賴性及其抗腫瘤機(jī)制。

筆者通過體外觀察兩株人腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，對景洪哥納香醇提物抗腫瘤活性進(jìn)行初探，以期為景洪哥納香的抗腫瘤活性研究提供必要的前期基礎(chǔ)。[KH*1D]

參考文獻(xiàn)：

[1]范治軍，崔英中草藥抗腫瘤的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)學(xué)文摘（腫瘤學(xué)），2005 02：152-153

[2]中國科學(xué)院編輯委員會中國植物志[M].第30 卷北京：科學(xué)出版社，1978：64

[3]中國科學(xué)院昆明植物研究所云南植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1991：51

[4]劉延澤，陳士林，馬培，等中草藥中發(fā)現(xiàn)新抗癌藥物的途徑[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2012，04：323-337

篇(5)

【關(guān)鍵詞】 神經(jīng)干細(xì)胞

［摘要］回顧國內(nèi)外有關(guān)阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease， AD）與神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell， NSC）關(guān)系的文獻(xiàn)，結(jié)合針刺治療AD的實(shí)驗(yàn)研究成果，提出針刺原位誘導(dǎo)AD海馬內(nèi)源性NSC的增殖分化，可能是針刺治療AD的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究針刺治療AD提供了新的思路和方向。

［關(guān)鍵詞］阿爾茨海默病; 神經(jīng)干細(xì)胞; 針刺療法

Pondering insitu induction of endogenous neural stem cells in hippocampus of rats with Alzheimer disease by acupuncture

ABSTRACT Analysis of domestic and overseas literature on the relationship between Alzheimer disease (AD) and neural stem cells (NSC) shows that inducing the proliferation and differentiation of hippocampal endogenous NSC insitu by acupuncture is probably the mechanism of acupuncture therapy in treating AD， and that it may further improve the method for the research on AD.

KEY WORDS Alzheimer disease; neural stem cell; acupuncture therapy

阿爾茨海默病（Alzheimer disease， AD）是一種神經(jīng)退行性疾病。其特征性病理變化為：淀粉樣蛋白沉積、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、基底前腦和海馬區(qū)的神經(jīng)元數(shù)目減少，并以海馬區(qū)受累最為嚴(yán)重，神經(jīng)元平均減少達(dá)47%［1］。目前全世界有2 000～2 500萬AD患者，2050年將超過3 000萬［2］，我國的AD患者已超過500萬。有專家估計，我國用于治療AD患者的費(fèi)用，每年至少需50億，到2050年，預(yù)期費(fèi)用將超過10 000億［2］。因此，防治AD已成為全社會高度關(guān)注的問題。

1AD的神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)策略

有研究認(rèn)為，神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell， NSC）將為AD的治療帶來革命性的前景［3～6］。早在2001年，在美國國立衛(wèi)生研究院向美國國會呈遞的干細(xì)胞科學(xué)研究總結(jié)性報告中就指出：神經(jīng)系統(tǒng)疾病的干細(xì)胞研究是極少的有證據(jù)顯示能用細(xì)胞替換療法修復(fù)神經(jīng)喪失功能的研究領(lǐng)域之一［7］。NSC的修復(fù)方法主要有兩種。一是在實(shí)驗(yàn)室里，將未分化的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)為適合移植到患者體內(nèi)的已分化細(xì)胞。方法是在種植前就把這些細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使其向所需的已分化神經(jīng)細(xì)胞的方向分化，或者直接把它們種植到體內(nèi)，由體內(nèi)的信號來引導(dǎo)它們分化成熟為合適的腦細(xì)胞，即外源性移植。但這種方法主要存在免疫排斥、倫理道德以及胚胎來源有限等問題。另一種修復(fù)方法是依靠生長激素和其他營養(yǎng)因子（生長因子、激素）以及其他可以幫助細(xì)胞存活并生長的信號分子，通過激活患者自己的干細(xì)胞和體內(nèi)的修復(fù)機(jī)制來修復(fù)由疾病或損傷引起的損害，也即內(nèi)源性原位誘導(dǎo)。這一修復(fù)方法已經(jīng)成為AD等神經(jīng)變性疾病NSC研究的熱點(diǎn)［8～10］，它不僅可成為補(bǔ)償或替代丟失的海馬神經(jīng)元的新策略，還可以完全避免外源性NSC移植所帶來的一系列問題。

2AD的神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)研究思路

研究發(fā)現(xiàn)，AD病變自身存在內(nèi)源性NSC的增殖活化。在正常成年個體，內(nèi)源性NSC主要存在于環(huán)繞側(cè)腦室的大腦室下帶、紋狀體、海馬等部位。正常情況下它們處于靜止?fàn)顟B(tài)，在疾病或某些生長因子的刺激下能被誘導(dǎo)、活化，以替代疾病中缺乏的神經(jīng)細(xì)胞［11～13］。在國外，Jin 等［14，15］研究了AD病變與NSC增殖活化之間的關(guān)系。他們以AD患者腦組織作為研究對象，發(fā)現(xiàn)在AD患者的海馬組織中，與NSC增殖分化相關(guān)的蛋白標(biāo)志物doublecortin、多唾液酸神經(jīng)元黏附分子、TUC4（TOAD/Ulip/CRMP）和微管相關(guān)蛋白（microtubule associated protein， MAP）均呈現(xiàn)高表達(dá)；接著他們以轉(zhuǎn)基因小鼠AD模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在靜息NSC集中的兩個區(qū)域，即環(huán)繞側(cè)腦室的大腦室下帶和海馬齒狀回顆粒下層均有NSC的增殖活化。在國內(nèi)，金國華等［16～18］以切斷穹隆海馬傘作為AD模型，研究結(jié)果表明：穹隆海馬傘切斷后第7天時，MAP陽性神經(jīng)元較多，胞體大、突起長，第14天時細(xì)胞進(jìn)一步遷移、成熟；正常組第7天時僅見少量突起短的MAP陽性神經(jīng)元，第14天時細(xì)胞稍增多，突起稍增長；對照組第7天時未見MAP陽性神經(jīng)元，第14天時僅有少量胞體小、突起短的MAP陽性神經(jīng)元；而且，穹隆海馬傘切割側(cè)的海馬提取液可明顯促進(jìn)NSC分化為神經(jīng)元和膽堿能陽性神經(jīng)元。這些研究表明：AD病變自身可作為一種刺激原，誘導(dǎo)內(nèi)源性NSC增殖活化。但AD病變后內(nèi)源性NSC的增殖活化對AD病變是有利還是有害呢？研究發(fā)現(xiàn)，給予NSC增殖活化的特異性抑制劑甲基氧化偶氮甲醇（methylazoxymethanol， MAM）后，不僅NSC的增殖活化受到抑制，同時學(xué)習(xí)記憶能力亦下降［19，20］。提示：AD病變后內(nèi)源性NSC的增殖活化是機(jī)體實(shí)現(xiàn)自身修復(fù)的一種潛力。但是為什么AD仍呈進(jìn)行性發(fā)展呢？有研究認(rèn)為，除了與增殖分化的速度慢于凋亡的速度有關(guān)外，還與機(jī)體存在抑制NSC增殖分化的因素有關(guān)［14，15］。

加強(qiáng)促進(jìn)NSC增殖分化的因素或解除抑制NSC增殖分化的因素，都將有利于AD患者海馬內(nèi)源性NSC的增殖分化，實(shí)現(xiàn)AD的治療效應(yīng)。周思朗等［21］從增加神經(jīng)營養(yǎng)類物質(zhì)以促進(jìn)原位誘導(dǎo)內(nèi)源性NSC增殖分化的角度，采用前腦Meynert基底核注射紅藻氨酸形成的AD模型，每天予以側(cè)腦室注射堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor， bFGF），7 d后發(fā)現(xiàn)，室管膜下區(qū)及海馬齒狀回代表NSC的溴脫氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine， BrdU）陽性細(xì)胞明顯增加，提示bFGF可促進(jìn)AD模型大鼠腦內(nèi)NSC的增殖分化；同時，AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力亦有所改善。此外，對表皮生長因子（epidermal growth factor， EGF）［22］、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子［23，24］、血管內(nèi)皮生長因子［25］和胰島素樣生長因子1［26］等的研究也獲得了類似的結(jié)果。一些學(xué)者則從抑制NSC增殖分化因素的角度進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：海馬齒狀回內(nèi)骨形態(tài)發(fā)生蛋白及其受體的高水平表達(dá)，是抑制海馬NSC增殖分化的關(guān)鍵因素［27～29］。抑制內(nèi)源性noggin蛋白的表達(dá)，可使NSC增殖分化降低，同時學(xué)習(xí)記憶能力下降［30］；給予側(cè)腦室注射外源性noggin蛋白，可拮抗骨形態(tài)發(fā)生蛋白4，促進(jìn)NSC增殖分化，增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力［31，32］。此外，給予EGF和FGF或兩種以上物質(zhì)進(jìn)行聯(lián)合注射，亦可獲得類似的結(jié)果［33］。雖然動物腦內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)已取得了很好的療效，但要在臨床推廣應(yīng)用仍存在難以長期堅持的問題。聯(lián)合注射的療效可能更好，但究竟如何進(jìn)行聯(lián)合，目前尚無明確的答案。

3神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)研究的針刺介入

臨床研究［34~36］表明：針刺治療AD主要在于改善認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶的能力。在其作用機(jī)制的研究方面，已經(jīng)進(jìn)行了針刺治療AD的行為學(xué)、神經(jīng)遞質(zhì)（乙酰膽堿、興奮性氨基酸等）、血漿一氧化氮、細(xì)胞因子、血清β淀粉樣蛋白、生長因子、突觸可塑性和信號傳導(dǎo)［37～45］等多方面的研究，但尚無應(yīng)用針刺原位誘導(dǎo)內(nèi)源性NSC進(jìn)行AD治療的作用機(jī)制研究的相關(guān)報道。但針刺原位誘導(dǎo)AD海馬內(nèi)源性NSC具有其自身的優(yōu)勢和極大的可行性。在自身優(yōu)勢方面，針刺療法的作用原理不是從外部向機(jī)體增加物質(zhì)，而是充分調(diào)動機(jī)體自身的內(nèi)在潛力，發(fā)揮治療和調(diào)整效應(yīng)，這樣可以避免NSC外源性移植或注射誘導(dǎo)所帶來的倫理道德、免疫排斥以及難于長期堅持等問題。其次，有研究發(fā)現(xiàn)［46］，外源性給予兩種或兩種以上的某些物質(zhì)進(jìn)行聯(lián)合誘導(dǎo)，效應(yīng)會是1＋1＞2，但哪些物質(zhì)進(jìn)行聯(lián)合誘導(dǎo)效應(yīng)最佳，尚未有明確的結(jié)論。目前公認(rèn)，針刺療法具有綜合性、整體性、雙向性等自身調(diào)整的特點(diǎn)和優(yōu)勢，可以從多環(huán)節(jié)、多途徑進(jìn)行調(diào)整。它既可能增強(qiáng)NSC增殖活化的因素，也可能解除抑制NSC增殖活化的因素，從而發(fā)揮最大的誘導(dǎo)效應(yīng)。針刺原位誘導(dǎo)除了有自身的優(yōu)勢外，還有極大的可行性。首先是間接依據(jù)方面，目前針刺對脊髓損傷、腦梗死和帕金森病后NSC作用的研究已取得部分成果。Cui等［47］制作大鼠脊髓損傷模型后，行督脈電針，1次/d，電針7 d后，檢測NSC增殖和分化標(biāo)記物nestin的表達(dá)。結(jié)果顯示：在督脈電針后第7、14、21和28天，nestin的表達(dá)均增加，且增加的nestin陽性細(xì)胞數(shù)與神經(jīng)功能改善相平行。李常新等［48］研究表明：電針可通過干預(yù)腦內(nèi)內(nèi)源性NSC的變化促進(jìn)腦梗死的恢復(fù)。電針治療不僅可促進(jìn)室管膜下層、病灶周圍及海馬NSC的增生，促進(jìn)急性期新生神經(jīng)元的增多，還可使病灶周圍、遷移流動帶處及海馬移行細(xì)胞及移行的NSC增多，增加移行的新生神經(jīng)元。我們在已完成的“電針對帕金森小鼠NSC多巴胺神經(jīng)元突觸形態(tài)與功能可塑性影響的研究”中發(fā)現(xiàn)，針刺可誘導(dǎo)黑質(zhì)致密部內(nèi)源性腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子［49］和NSC標(biāo)記物nestin的表達(dá)，促進(jìn)NSC的增殖、分化，從而促進(jìn)突觸可塑性的發(fā)揮。這些研究結(jié)果為針刺原位誘導(dǎo)AD海馬NSC的可能性提供了間接的依據(jù)。在直接依據(jù)方面，我們在已結(jié)題的“電針促進(jìn)老年癡呆大鼠海馬神經(jīng)元突觸可塑性的影響及機(jī)制”的研究中發(fā)現(xiàn)，電針可以誘導(dǎo)老年癡呆大鼠海馬內(nèi)源性神經(jīng)生長因子、一氧化氮和cfos的表達(dá)，從而增強(qiáng)海馬殘存神經(jīng)元形態(tài)的可塑性，發(fā)揮其代償功能［43］；同時，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的海馬膽堿能神經(jīng)元陽性數(shù)目增多，乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng)。結(jié)合Calza 等［50］的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)生長因子可以誘導(dǎo)海馬NSC定向分化為膽堿能神經(jīng)元，我們認(rèn)為：針刺療法極有可能是通過增強(qiáng)海馬內(nèi)源性神經(jīng)生長因子的表達(dá)，促進(jìn)了海馬內(nèi)源性NSC的增殖活化，并定向分化形成新生的膽堿能神經(jīng)元。如果能作進(jìn)一步的深入研究，將會為針刺治療AD作用機(jī)制的研究提供新的思路和方向。

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篇(6)

論文關(guān)鍵詞：基因治療,移植靜脈,再狹窄

隨著醫(yī)療水平的發(fā)展，像靜脈移植等手術(shù)方法治療包括冠狀動脈在內(nèi)的血管狹窄等疾病給病人生活帶來新的希望，但術(shù)后通暢率逐年下降又給病人帶來新的憂慮。目前對預(yù)防移植靜脈再狹窄主要手段有放射、藥物、物理治療，雖然有一定成效，但效果還是不佳，隨著生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們將希望寄托于基因治療。下面將對基因治療中目的基因和載體的選擇進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1.目的基因的種類靜脈橋再狹窄主要機(jī)制就是內(nèi)皮細(xì)胞的損傷；血栓形成；平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖。這為我們目的基因的選擇提供依據(jù)。

1.1促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)的基因。

1.1.1內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)一氧化氮（NO）是體內(nèi)重要的生物信使分子和效應(yīng)分子，它具有抑制vsmc增殖、遷移，抑制血小板聚集等功能。而eNOS是NO合成的關(guān)鍵酶，通過將eNOS基因局部轉(zhuǎn)移，是防止移植血管狹窄的有效手段。王曉明等通過給靜脈橋轉(zhuǎn)染帶有eNOS基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，再旁路移植到動脈后得出其加速內(nèi)皮細(xì)胞再生、抑制血栓形成，進(jìn)而抑制內(nèi)膜增生。

1.1.2血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)VEGF能高效的刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，使損傷的內(nèi)皮盡快得到修復(fù)，也可以間接抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖。VEGF165是最主要的異構(gòu)體，是其生物學(xué)作用的主要形式，也是目前的基因治療中主要選用的異構(gòu)體。有研究表明通過腺病毒介導(dǎo)的VEGF過度表達(dá)可以使球囊損傷的動脈內(nèi)皮細(xì)胞再生，抑制血管內(nèi)膜增殖。

1.1.3肝細(xì)胞生長因子(HGF):HGF是一種間質(zhì)細(xì)胞衍生的多功能細(xì)胞因子，能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂和增殖,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的修復(fù)，但不引起VSMC的增殖。有研究表明轉(zhuǎn)染HGF基因可增強(qiáng)球囊損傷后血管內(nèi)皮組細(xì)胞的功能，有效抑制損傷血管的狹窄。

1.2抗血栓形成的基因。

1.2.1組織因子途徑抑制物(TFPI)TFPI是相對穩(wěn)定的糖蛋白，是廣譜的Kunitz類型絲氨酸蛋白酶抑制物，其具有很強(qiáng)的抗凝作用。有研究表明通過腺病毒介導(dǎo)TFPI基因局部轉(zhuǎn)染可以顯著抑制PICA術(shù)后血栓形成和內(nèi)膜增厚，主要是通過促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）凋亡而抑制血管的狹窄的。

1.2.2組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)t-PA纖溶酶原激活劑主要物質(zhì)之一，主要有血管內(nèi)皮細(xì)胞合成。其主要功能就是裂解纖溶酶原肽鍵，形成具有活性的纖溶酶。Ross報道t-PA減少能使經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)(PTcA)后血管狹窄,可見t-PA在預(yù)防血管狹窄中起到比較重要的作用。t-PA不僅能預(yù)防血管狹窄，有項(xiàng)研究也表明tPA基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體直接注入介入手術(shù)后再狹窄動物模型的血管壁可以減輕狹窄面積，甚至能達(dá)到30%。

1.3抑制VSMC增殖遷移的基因。

自體移植靜脈再狹窄的主要病理特征為內(nèi)膜顯著增厚。增厚內(nèi)膜主要是由血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移等因素形成，其中有很多調(diào)節(jié)步驟參與當(dāng)中。這為我們抑制VSMC增殖、遷移提供許多候選基因。單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）是一種能使無活性的核昔類似物輕甲基無環(huán)鳥苷轉(zhuǎn)化為磷酸化的細(xì)胞毒性形式，誘導(dǎo)DNA鏈合成中止引起細(xì)胞死亡。實(shí)驗(yàn)研究表明HSV-tk基因能抑制新生內(nèi)膜形成、降低內(nèi)膜面積與中膜面積的比值(I：M)。FAS是一種凋亡受體，在VSMC中表達(dá)較多，當(dāng)FAS配體在血管壁上表達(dá)也可以降低新生內(nèi)膜的形成。抗細(xì)胞遷移金屬基質(zhì)蛋白酶(MMPs)基因在VSMC的遷移中有十分重要的作用,組織型金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP1)及其同家族成員都有顯著減低I:M比例.

1.4聯(lián)合基因治療

由于預(yù)防移植靜脈狹窄干預(yù)靶點(diǎn)太多,而誰是關(guān)鍵基因尚未確定,又加上單一靶點(diǎn)效果并不理想,于是有人聯(lián)合多個基因進(jìn)行干預(yù),證明比單一基因干預(yù)更有效。Gunn等用C-myb的反義核酸得出能抑制豬經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)后的內(nèi)膜增生.VanBelle等在兔股動脈上給予VEGF165質(zhì)?？梢约铀賰?nèi)皮化,減少附壁血栓和新生內(nèi)膜形成。張鐵民等實(shí)驗(yàn)顯示,反義寡核苷酸與VEGF聯(lián)合應(yīng)用較兩者單用更能顯著預(yù)防再狹窄。

2.載體的種類為了獲得一個好的臨床治療效果，載體的選擇是重要的一步。載體就是將目的基因?qū)胩厥獠课坏墓ぞ撸ǔ７譃椴《据d體和非病毒載體，它們各有自己的優(yōu)缺點(diǎn)。

2.1病毒載體的種類

2.1.1腺病毒載體腺病毒是無包膜的線性雙鏈DNA病毒，目前的腺病毒載體大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）為基礎(chǔ)。腺病毒主要優(yōu)點(diǎn)有轉(zhuǎn)染細(xì)胞廣泛、攜帶的DNA量大、感染效率高、重組病毒滴度高、不整合到宿主細(xì)胞、理化性質(zhì)穩(wěn)定等。以腺病毒介導(dǎo)的基因治療預(yù)防血管狹窄的研究層出不窮。體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)時間短暫、病毒基因表達(dá)的產(chǎn)物引起的毒性反應(yīng)限制腺病毒這個載體的應(yīng)用。正因如此，對腺病毒載體的改進(jìn)正在進(jìn)行，如經(jīng)RGD-4C整合素靶向多肽改良后的腺病毒在靜脈橋中有更好的轉(zhuǎn)染能力

2.1.2腺相關(guān)病毒載體（rAAV）rAAV源于非致病的野生型腺相關(guān)病毒，由于其安全性好、宿主細(xì)胞范圍廣、免疫源性低，在體內(nèi)表達(dá)外源基因時間長等特點(diǎn)，被視為最有前途的基因轉(zhuǎn)移載體之一。

通用的AAV載體都是基于血清型2，即AAV2。因?yàn)閞AAV感染效率低、制備成本高且只能包裝小于4.7kb的基因序列而在基因治療中受到限制。

2.1.3慢病毒載體慢病毒載體（LVs）是在HIV-1病毒基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，它能高效的將目的基因?qū)雱游锖腿说脑?xì)胞或細(xì)胞系。LVs具有免疫原性低、整合到細(xì)胞上長期表達(dá)、可感染非分裂期與分裂期細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn).已有研究表明慢病毒載體應(yīng)用于球囊損傷致血管狹窄研究的可行性。但慢病毒仍具有潛在的產(chǎn)生復(fù)制型慢病毒（RCL）和致癌的風(fēng)險，相關(guān)的研究還是有待加強(qiáng)。

2.2非病毒載體非病毒載體是通過哺乳細(xì)胞攝取和細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)大分子物質(zhì)的機(jī)制來把目的基因轉(zhuǎn)入靶器官。雖然非病毒載體具有安全、易得、無免疫源性等優(yōu)點(diǎn)，但是他們基本上轉(zhuǎn)染效率不高，因此早期在基因治療研究中沒有太高的地位。隨著技術(shù)的進(jìn)步，非病毒載體在基因治療載體選擇上占有一定份額，尤其表現(xiàn)在納米粒子、超聲微泡載體上。

2.2.1超聲微泡載體：它的作用原理是通過超聲的物理效應(yīng)使細(xì)胞膜上產(chǎn)生可逆的小孔，借助此孔外源性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。Taniyama等通過超聲微泡載體將p53的cDNA轉(zhuǎn)入球囊損傷大鼠頸動脈，得出血管內(nèi)膜和中膜面積的比值顯著降低。雖然超聲微泡靶向釋放技術(shù)的靶向性及無創(chuàng)性的優(yōu)點(diǎn)已達(dá)到大部分實(shí)驗(yàn)的認(rèn)可，但其轉(zhuǎn)染效率不高仍是需要大力研究的。

2.2.2納米粒子：它是現(xiàn)在研究比較熱門一種非病毒載體，主要是可以使被包裹的目的基因免受水解酶的降解，將目的基因運(yùn)載到血管平滑肌上，達(dá)到治療疾病的目的。胡新華等通過納米粒子介導(dǎo)的反義雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因抑制移植靜脈內(nèi)膜增生得出納米粒子在血管狹窄治療中是可行的。現(xiàn)在用的納米粒子主要是PLGA，它有很好的組織相容性，產(chǎn)物沒有任何毒性。

3.總結(jié)和展望

這些年來盡管科研及醫(yī)務(wù)工作者在移植靜脈獲取技術(shù)、藥物防治、應(yīng)用血管外支架和放射治療等方面做了大量的工作并在預(yù)防移植靜脈再狹窄上取得一定成效，但是總體效果還是不理想。移植后的靜脈因?yàn)閮?nèi)皮細(xì)胞損傷、炎性細(xì)胞浸潤、平滑肌細(xì)胞遷移增殖、細(xì)胞外基質(zhì)增加等一系列病理改變導(dǎo)致移植靜脈再狹窄。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，安全、高效的載體出現(xiàn)、多基因聯(lián)合等綜合治療必將能有效預(yù)防血管再狹窄。

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篇(7)

1 材料和方法

1.1 試劑

ACC高轉(zhuǎn)移株ACCM、低轉(zhuǎn)移株ACC2由四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。Trizol試劑盒（Life Technologies公司，美國），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒（TaKaRa公司，日本），MMP9抗體、山羊抗兔二抗、辣根過氧化物酶復(fù)合物及顯色劑DAB抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抗體（Bioworld Technology公司，美國），磷酸化表皮生長因子受體（phospho-rylation epidermal growth factor receptor，P-EGFR）、磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（phosphorylation extra-cellular signal-regulated kinase，P-ERK）、KGF抗體（Abcam公司，美國）。過氧化物酶標(biāo)記的二抗及增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物（Millipore公司，美國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

ACC細(xì)胞培養(yǎng)：在RPMI 1640、10%小牛血清、100 U·mL-1青霉素及100 μg·mL-1鏈霉素培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，細(xì)胞傳代采用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞。細(xì)胞生長至70%～80%用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

取對數(shù)期生長的ACC2接種于培養(yǎng)面積為25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，設(shè)定壓力強(qiáng)度為103.74 kPa，根據(jù)加壓時間不同將實(shí)驗(yàn)組分為3 h組、6 h組、12 h組、24 h組。另外將加壓培養(yǎng)的ACC2設(shè)置為陰性對照組，未加壓培養(yǎng)的ACCM設(shè)置為陽性對照組。

1.4 免疫組織化學(xué)法半定量檢測EGFR的表達(dá)

將密度為5×104個·mL-1的細(xì)胞懸液滴于爬片中央，待細(xì)胞貼壁后，在孔板內(nèi)追加培養(yǎng)基，孵育過夜，于103.74 kPa加壓3、6、12、24 h后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定15 min。所有的細(xì)胞爬片均按免疫ABC法進(jìn)行檢測。3%過氧化氫液37 ℃孵育20 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；羊血清37 ℃封閉30 min；滴加EGFR抗體4 ℃過夜，次日37 ℃復(fù)溫1 h；二抗37 ℃孵育30 min；辣根過氧化物酶復(fù)合物37 ℃ 30 min，DAB顯示1 min。設(shè)立空白對照：兔血清代替一抗；陰性對照：PBS代替一抗。顯微鏡下細(xì)胞膜及細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒即為EGFR表達(dá)陽性。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase poly-merase chain reaction，RT-PCR）法檢測MMP9和EGFR mRNA的表達(dá)取各組細(xì)胞，以Trizol試劑盒方法提取總RNA，取等量RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA，經(jīng)Taq-DNA聚合酶作用擴(kuò)增目標(biāo)基因MMP9、EGFR、GAPDH。以GAPDH為內(nèi)參，分析MMP9和EGFR基因的mRNA水平。以未加壓組基因的表達(dá)量為基線，分析各處理組表達(dá)量的改變。MMP9引物序列：5’TCCAGTAGACAATCCTTGCAATGTG3’（正義鏈），5’CTC-CGTGATTCGAGAACTTCCAATA3’（反義鏈）；EGFR引物序列：5’GAGTAACAAGCTCACGCAG-TTG3’（正義鏈），5’GAGGAC ATAACCAGCCA-CCTC3’（反義鏈）；GAPDH引物序列：5’CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC3’（正義鏈），5’GTA-GAGGCAGGGATGATGTTCT3’（反義鏈）。

1.6 Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

取對數(shù)期生長的細(xì)胞，以PBS清洗，加入細(xì)胞裂解混合液后，將細(xì)胞刮下，14 000 r·min-1離心15 min，取上清并[專業(yè)提供寫作論文和論文寫作服務(wù)，歡迎您的光臨dylw.net]行蛋白含量測定。加入等體積5×SDS-PAGE上樣緩沖液，置沸水浴中加熱10 min。樣本在10% SDS-PAGE凝膠中電泳，電壓100 V。電泳完成后濕轉(zhuǎn)或半干PVDF膜上，再將此膜于4 ℃封閉過夜。次日按Western blot試劑盒說明書，利用抗人MMP9、EGFR、P-EGFR、KGF、P-ERK單抗進(jìn)行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 加壓環(huán)境對細(xì)胞內(nèi)EGFR表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果表明：陰性對照組ACC2低表達(dá)EGFR，隨著加壓時間延長，實(shí)驗(yàn)組EGFR表達(dá)逐漸增加，整體呈時間正相關(guān)性，加壓12 h后達(dá)到最大，與陽性對照組ACCM的表達(dá)接近（圖1）。

Western blot檢測結(jié)果表明：1）與陰性對照組相比，實(shí)驗(yàn)組EGFR的表達(dá)量在加壓3 h后達(dá)到峰值，超過了陽性對照組中EGFR蛋白表達(dá)量，但是其蛋白表達(dá)量并未隨著加壓時間延長而逐步增加，在加壓24 h后降至與陰性對照組相似水平。盡管EGFR的表達(dá)量未體現(xiàn)出明顯的時間相關(guān)性，但在加壓后，總蛋白的表達(dá)量仍有明顯的上調(diào)。2）實(shí)驗(yàn)組P-EGFR的表達(dá)量呈時間正相關(guān)性，隨著加壓時間的延長，P-EGFR蛋白表達(dá)量逐漸增長，并在加壓24 h后達(dá)到峰值，而陽性對照組及陰性對照組中P-EGFR均為低表達(dá)（圖2）。

2.2 加壓環(huán)境對MMP9和EGFR mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR法檢測結(jié)果表明：MMP-9和EGFR mRNA的表達(dá)量在加壓6 h開始上 調(diào)，在加壓24 h達(dá)到最大，表達(dá)量整體表現(xiàn)出時間正相關(guān)性。MMP-9加壓24 h后其表達(dá)量是陰性對照組的3.8倍，EGFR加壓24 h其表達(dá)量是陰性對照組的4.5倍（圖3）。

2.3 壓力刺激對轉(zhuǎn)移黏附相關(guān)蛋白的影響

Western blot檢測結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組隨著加壓時間的延長，MMP9、KGF、P-ERK蛋白的表達(dá)量均逐漸增加。MMP9及P-ERK的表達(dá)量在加壓6 h后明顯增加，加壓24 h后略有降低；KGF的表達(dá)量與時間呈正相關(guān)，蛋白表達(dá)量在加壓24 h后達(dá)到最大。陰性對照組的MMP9、KGF、P-ERK均低表達(dá)。

3 討論

為了驗(yàn)證腫瘤微環(huán)境能與各種基因相互作用，本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)半定量檢測不同加壓時間對EGFR表達(dá)的影響，結(jié)果顯示ACC2細(xì)胞在間質(zhì)液壓升高的情況下上調(diào)EGFR表達(dá)量。為了更準(zhǔn)確地證明間質(zhì)液壓的升高可以影響EGFR蛋白水平的表達(dá)，本研究還采用Western blot方法檢測了EGFR及P-EGFR的表達(dá)情況，結(jié)果也證實(shí)了腫瘤微環(huán)境中間質(zhì)液壓與ACC2中蛋白表達(dá)改變的相關(guān)性。

MMP9與細(xì)胞侵襲遷移能力相關(guān)，且ACC細(xì)胞的侵襲性與加壓時間呈正相關(guān)性[7]。本實(shí)驗(yàn)中檢測了MMP9的mRNA及蛋白表達(dá)量，RT-PCR結(jié)果顯示IFP的升高可從mRNA水平上調(diào)MMP9基因的表達(dá)，從而改變細(xì)胞的生物學(xué)行為，進(jìn)一步證實(shí)了腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用；然而蛋白水平的檢測結(jié)果卻是在加壓環(huán)境中MMP9的蛋白表達(dá)量并未隨時間延長而逐步增加，僅在加壓6 h及12 h后出現(xiàn)了表達(dá)高峰。筆者推測，在ACC中可能還存在其他的與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子。研究認(rèn)為：P-ERK的上調(diào)與ACC肺轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系[專業(yè)提供寫作論文和論文寫作服務(wù)，歡迎您的光臨dylw.net]，KGF是與腺樣囊性癌密切相關(guān)的黏附相關(guān)分子，加之腫瘤微環(huán)境中IFP的升高也為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供了有利環(huán)境[4，8-9]。在本實(shí)驗(yàn)中筆者檢測了加壓環(huán)境中P-ERK及KGF在ACC中的表達(dá)情況。Western blot結(jié)果在一定程度上證實(shí)了這兩種蛋白的表達(dá)量隨著加壓時間的延長而逐步增加。這就為加壓環(huán)境中腺樣囊性癌侵襲轉(zhuǎn)移能力增加提供了分子基礎(chǔ)。同時蛋白水平的檢測也證實(shí)了EGFR及P-EGFR的表達(dá)量隨著環(huán)境的改變而改變。這一結(jié)果表明腫瘤微環(huán)境可與腫瘤細(xì)胞相互作用，改變細(xì)胞的生物學(xué)行為。隨著IFP的升高，細(xì)胞內(nèi)與惡性表型相關(guān)的基因及蛋白表達(dá)量增加，為ACC2侵襲轉(zhuǎn)移提供了分子基礎(chǔ)。

IFP的升高與調(diào)控血管生成的基因相關(guān)，降低其表達(dá)或者改善間質(zhì)流體動力學(xué)可早期降低IFP，從而利于常規(guī)放化療的進(jìn)行[4]。血管內(nèi)皮生長因子（vas-cular endothelial growth factor，VEGF）、碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydrase Ⅸ，CAⅨ）、丙酮酸脫氫酶激酶1等基因產(chǎn)物可改變血管的滲透性，降低間質(zhì)液壓，改善細(xì)胞外酸化和缺氧，從而克服腫瘤微環(huán)境成為治療屏障這一問題[10]。趨化因子受體CXCR4與腺樣囊性癌的組織學(xué)類型及轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)性。在高壓環(huán)境下黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）以及Src的激活有利于直腸癌細(xì)胞的黏附。那么IFP的升高會影響ACC細(xì)胞的黏附能力嗎？能否解釋ACC的極易復(fù)發(fā)、早期轉(zhuǎn)移以及神經(jīng)侵襲性的生物學(xué)行為呢？因此在今后的實(shí)驗(yàn)中，將繼續(xù)檢測與血管相關(guān)的分子（如血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子、VEGF-A、VEGF-C及組織纖維蛋白溶酶原激活劑以及Src等）在加壓環(huán)境中表達(dá)量是否改變，進(jìn)一步建立體內(nèi)模型；并且，利用VEGF抑制劑、CAⅨ以及丙酮酸脫氫酶激酶1的基因產(chǎn)物來改善腫瘤微環(huán)境中升高的間質(zhì)液壓，觀察ACC的生物學(xué)行為以及上述指標(biāo)的表達(dá)情況，為腫瘤治療提供理論依據(jù)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明，腫瘤微環(huán)境中間質(zhì)液壓的升高可從mRNA及蛋白水平兩方面影響MMP9、KGF、P-ERK的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、黏附、遷移和侵襲能力。

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