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攜帶NMU2R shRNA重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及其評價
郭莉霞; 殷鐘意; 鄭旭煦 重慶工商大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院; 重慶400067; 天然藥物研究重慶高校市級重點實驗室; 重慶400067
- neuromedin
- u
- 2受體
- rna干擾
- 重組腺相關(guān)病毒
摘要：構(gòu)建穩(wěn)定表達 NMU2R shRNA的重組腺相關(guān)病毒載體,制備并純化靶向性沉默 NMU2R 表達的高滴度重組腺相關(guān)病毒。首先設(shè)計合成 NMU2R shRNA,退火形成雙鏈與pAAV-ZsGreen-shRNA質(zhì)粒 Bam H I和 Hin d III雙酶切產(chǎn)物相連接構(gòu)建形成質(zhì)粒pAAV-ZsGreen-r NMU2R shRNA,經(jīng)雙酶切和測序鑒定證實,重組質(zhì)粒克隆正確,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到AAV-293包裝細(xì)胞中包裝成腺相關(guān)病毒載體,成功制備重組腺相關(guān)病毒rAAV5-ZsGreen-r NMU2R shRNA,經(jīng)測定純化所得rAAV5病毒滴度為1×10^12 vg/mL。最后將rAAV5-ZsGreen-r NMU2R shRNA感染大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12,檢測 NMU2R shRNA基因沉默效果,利用空病毒載體pAAV-ZsGreen-shRNA作對照,Real-time PCR及Western Blot方法測得 NMU2R mRNA及蛋白表達水平與對照組相比顯著下降。綜上,成功構(gòu)建了高滴度攜帶 NMU2R shRNA重組腺相關(guān)病毒載體rAAV5-ZsGreen-r NMU2R shRNA。
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- u
- 2受體
- rna干擾
- 重組腺相關(guān)病毒
摘要：構(gòu)建穩(wěn)定表達 NMU2R shRNA的重組腺相關(guān)病毒載體,制備并純化靶向性沉默 NMU2R 表達的高滴度重組腺相關(guān)病毒。首先設(shè)計合成 NMU2R shRNA,退火形成雙鏈與pAAV-ZsGreen-shRNA質(zhì)粒 Bam H I和 Hin d III雙酶切產(chǎn)物相連接構(gòu)建形成質(zhì)粒pAAV-ZsGreen-r NMU2R shRNA,經(jīng)雙酶切和測序鑒定證實,重組質(zhì)粒克隆正確,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到AAV-293包裝細(xì)胞中包裝成腺相關(guān)病毒載體,成功制備重組腺相關(guān)病毒rAAV5-ZsGreen-r NMU2R shRNA,經(jīng)測定純化所得rAAV5病毒滴度為1×10^12 vg/mL。最后將rAAV5-ZsGreen-r NMU2R shRNA感染大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12,檢測 NMU2R shRNA基因沉默效果,利用空病毒載體pAAV-ZsGreen-shRNA作對照,Real-time PCR及Western Blot方法測得 NMU2R mRNA及蛋白表達水平與對照組相比顯著下降。綜上,成功構(gòu)建了高滴度攜帶 NMU2R shRNA重組腺相關(guān)病毒載體rAAV5-ZsGreen-r NMU2R shRNA。
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生物學(xué)
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- 生物 快捷分類
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主管單位：安徽省科學(xué)技術(shù)協(xié)會;主辦單位：合肥市科學(xué)技術(shù)協(xié)會
